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禽流感病毒H7亚型核酸荧光PCR检测试剂盒

                     禽流感病毒H7亚型核酸荧光PCR检测试剂盒

前言

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,是针对禽流感病毒H7亚型设计的检测体系,用于血液、粪便、鼻拭子和咽拭子等样本的检测。试剂盒组成

组成成份

   

核酸扩增试剂

 

RT-PCR反应液

994.5ul×1

Taq(5U/ul)

15.5ul×1

Enhancer

   10.5ul×1

对照品

 

阴性对照

25ul×1

阳性对照

25ul×1

 储存条件及有效期

本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为6个月。

 适用仪器(荧光PCR检测仪

ØABI公司Prism700073007500系列

Ø  RotorGene系列

Ø  Bio-Rad公司的iCycler系列

Ø  Roche LightCycler系列

 自备试剂

核酸提取试剂。

 样本采集、存放及运输

1. 样本采集:各类型样本按照常规方法采集。

2. 存放:样本在2℃—8℃条件下保存应不超过72h-70℃以下可长期保存,但应避免反复冻融(最多冻融3次)。

3. 运输:采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

 使用方法

     1.  样本处理

用户可采用病毒RNA提取试剂盒提取RNA用于检测。说明:阳性对照及阴性对照无需提取,直接上样。


2.  扩增试剂准备(PCR前准备区)

    从试剂盒中取出RT-PCR 反应液、TaqPCR Enhancer室温融化并振荡混匀后,2,000rpm离心10。设所需要的PCR反应管管数为nn = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:

 

RT-PCR

 反应液

Taq

PCR enchancer

 

19.5 ul

0.3 ul

0.2 ul

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2,000rpm离心10,向设定的nPCR 反应管中分别加入20 ul,转移至样本处理区。


 3.  加样(样本处理区)

    向所设定的nPCR 反应管中分别加入待检样本RNA、阴性对照和阳性对照各5ul,盖紧管盖,转移至检测区。将PCR 反应管排好放入PCR仪内,记录样本摆放顺序。

    4.  PCR扩增(检测区)

4.1  循环条件设置

50℃:30 min

95℃:3 min

95℃:5 sec, 60: 40 sec, 72℃:15 sec 40个循环。

荧光信号收集设在60℃。反应体系设为25ul

4.2  仪器检测通道选择

待测荧光为FAM荧光素,荧光PCR检测仪荧光信号收集设定为FAM荧光素。

 

结果分析条件设定

Ø  阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

Ø  基线(baseline)应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域(所有样本荧光信号无较大波动),起始点(循环数)应避开荧光采集起始阶段的信号波动,终止点(循环数)应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1-2个循环。

【注】具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

质控标准

1.  阴性对照的检测结果应为阴性;

2.  阳性对照的Ct值应小于等于32.0

否则,此次实验视为无效。


结果判断

1.  Ct值无读数的样本为阴性。

2.  Ct值≤38.0的样本为阳性。

3.  Ct值大于38.0的样本建议重做。重做结果Ct值<40.0为阳性,否则为阴性。


试剂盒使用注意事项

1.   有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

2.   本试剂盒仅用于体外检测。

3.   实验请严格分区操作:

第一区:PCR前准备区 准备扩增所需试剂;

第二区:样本处理区 待测样本和对照品处理;

第三区:检测区 PCR扩增检测。

4.   各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染,实验后即请清洁工作台。

5.   试剂盒内各试剂使用前,充分融化后请稍事离心。

6.   在-20℃保存的样本裂解产物,应在加样前置室温解冻,作短暂离心后使用。

7.   分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。

8.   加样时应使样品完全落入反应液中,不应有样品粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。

9.   扩增完毕立即取出反应管,密封在专用塑料袋内,丢弃于指定地点。

10. 反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。

11.  实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。 

12.  工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。