Chinese  
   
猪圆环病毒实时荧光PCR检测试剂盒

                              猪圆环病毒实时荧光PCR检测试剂盒

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,是针对猪瘟病毒设计的检测体系,用于疑似感染动物血清或组织等样本的检测。

【产品名称】

通用名称:猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

英文名称:Classical Swine Fever Virus Fluorescent PCR test kit

【试剂盒组成】

组成成份(25Tests/kit

规格

核酸扩增试剂

 

RT-PCR反应液

526.5µl×1

Taq(5U/µl)

8.5µl×1

PCR enhancer

5.5µl×1

对照品

 

阴性对照

25µl×1

阳性对照

25µl×1

注:不同批号的试剂组份不可混用。

【储存条件及有效期】

本试剂盒贮存于-20的条件下有效期为6个月。

【生产日期及批号】

详见包装袋和外包装盒。

【适用仪器(荧光PCR检测仪)

Ø   ABI公司Prism700073007500系列

Ø   RotorGene系列

Ø   Bio-Rad公司的iCycler系列

【自备试剂】

核酸提取试剂。

【样本采集、存放及运输】

1.样本采集:各类型样本按照常规方法采集。

2.存放:分离后的血清或者血浆样本在2—8条件下保存应不超过72h-70以下可长期保存,但应避免反复冻融(最多冻融3次)。

3.运输:采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

【检验方法】

1.样本处理:

用户可采用病毒RNA提取试剂盒提取RNA用于检测或保存于-20-80更佳)以待检测。说明:阳性对照及阴性对照无需提取,直接上样。

2.扩增试剂准备(PCR前准备区):

从试剂盒中取出RT-PCR 反应液、Taq酶及PCR Enhancer,室温融化并振荡混匀后,2000rpm离心10秒。设所需要的PCR反应管管数为nn = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:

 

试剂

RT-PCR反应液

Taq

PCR enchancer

用量

19.5 µl

0.3µl

0.2 µl

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10秒,向设定的nPCR反应管中分别加入20 µl,转移至样本处理区。

1.加样(样本处理区):

向所设定的nPCR 反应管中分别加入待检样本RNA、阴性对照和阳性对照各5µl,盖紧管盖,转移至检测区。将PCR反应管排好放入PCR仪内,记录样本摆放顺序。

2.PCR扩增(检测区)

4.1       循环条件设置

5010 min

953 min

9510sec, 60: 1min  40个循环。

荧光信号收集设在60。反应体系设为25ul

4.2       仪器检测通道选择

待测荧光为FAM荧光素,荧光PCR检测仪荧光信号收集设定为FAM荧光素。

3.结果分析条件设定:

5.1       阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

5.2       基线(baseline)应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域(所有样本荧光信号无较大波动),起始点(循环数)应避开荧光采集起始阶段的信号波动,终止点(循环数)应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1-2个循环。

注:具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

4.质控标准:

阴性对照的检测结果应为阴性;

阳性对照的Ct值应小于等于32.0

否则,此次实验视为无效。

1.结果判断:

Ø Ct值无读数的样本为阴性。

Ø Ct≤38.0的样本为阳性。

Ø Ct值大于38.0的样本建议重做。

重做结果Ct值<40.0为阳性,否则为阴性。

【试剂盒使用注意事项】

1. 有关实验室管理规范请严格按照行业行

2. 本试剂盒仅用于体外检测。

3. 实验请严格分区操作:

第一区:PCR前准备区——准备扩增所需试剂;

第二区:样本处理区——待测样本和对照品处理;

第三区:检测区——PCR扩增检测。

4. 各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染,实验后即请清洁工作台。

5. 试剂盒内各试剂使用前,充分融化后请稍事离心。

6. 在-20保存的样本裂解产物,应在加样前置室温解冻,作短暂离心后使用。

7. 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。

8. 加样时应使样品完全落入反应液中,不应有样品粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。

9. 扩增完毕立即取出反应管,密封在专用塑料袋内,丢弃于指定地点。

10. 反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。

11. 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

12. 工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒